Il continuo ampliamento dei fondi librari pose presto il problema dell'insufficienza dei locali.
Dopo varie ipotesi, la soluzione fu individuata destinando l'ex chiesa del Collegio dei Gesuiti a nuova sede della biblioteca.
Nel progetto di ristrutturazione fu adottata una soluzione considerata al tempo di avanguardia: la navata della chiesa venne divisa orizzontalmente per ospitare il magazzino librario, costituito da una struttura metallica antisismica e autoportante di quattro piani e, nella parte superiore, la sala di lettura.
I nuovi locali furono inaugurati nel dicembre 1935.
Con la costituzione del nuovo ministero, dal 1975 la Biblioteca è diventata un istituto periferico del Ministero per i Beni e le Attività Culturali.
A partire dal febbraio 2003 sino all'ottobre 2013 la Biblioteca ha aperto, sempre per carenza di spazio una sede al civico 38B di Via Balbi avvicinandosi al complesso che sarebbe divenuto la nuova sede della biblioteca. In questa seconda sede si è sperimentata l'apertura di ampi spazi a scaffale aperto collocati secondo il sistema di classificazione Dewey.
Tutto il materiale, gli uffici e parte dei servizi che avevano sede in Via Balbi 38b dall'ottobre 2013 vengono trasferiti nella nuova sede presso l'edificio dell'ex Hotel Colombia Excelsior in Via Balbi 40. Nel luglio 2014 la sede storica è stata definitivamente chiusa al pubblico.
Alla fine del 2019 tutte le raccolte trovano spazio nella nuova sede. La Sala III rimane nel suo "vaso" nell'attesa di poter essere consultata in loco (la consultazione può avvenire nella nuova sede su prenotazione).
Elenco cronologico dei Direttori della biblioteca
La storia per immagini: Dal Collegio dei Gesuiti all'Hotel Colombia